张梦丹，王浪，李伟，等.骆驼奶中外泌体对Ⅰ型糖尿病小鼠治疗的作用研究[J].食品研究与开发，2020，41（24）：8-11，64

ZHANG Mengdan，WANG Lang，LI Wei，et of Bactrian Camel Milk Exosomes on Blood Glucose and Body Weight in TypeⅠDiabetic Mice[J].Food Research and Development，2020，41（24）：8-11，64

随着人们饮食结构的改变，糖尿病患病率在逐渐上升，对我国人民健康的影响日趋严重，因此寻找方便可靠、安全绿色的方法来治疗糖尿病显得尤为重要[1]。骆驼奶是治疗慢性疾病一种食品[2]，它的成分包括免疫调节蛋白、脂肪酸、重要矿物质、维生素和外泌体等，它具有抵抗炎症、保护肝脏和心脏、降低血糖等作用[3-7]。外泌体（exosome）由不同来源的细胞产生，是天然存在于人乳、牛乳等各种乳源液体的一种分泌小体，直径为30 nm～150 nm的膜状纳米囊泡[8-9]，能够通过多种方式产生相互作用，如将受体与配体结合，进行胞吞作用等[10-11]。研究发现外泌体具有重要的生物学作用，可以作为检测和诊断疾病的生物标志物[12]，同时也可以作为细胞间交流的特殊媒介[13-15]。

本试验通过超高速离心的方法分离了骆驼奶中的外泌体，通过电镜和反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 法鉴定提取的外泌体。利用高糖高脂饲料加链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导普通小鼠为糖尿病模型小鼠，灌胃外泌体溶液，对试验小鼠血糖和体重进行测量，初步探讨骆驼奶中外泌体降糖效果，为进一步研究外泌体的效果奠定基础，也为糖尿病的新药开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5周～6周龄的雌性C57BL/6J小鼠：石河子大学；普通饲料、高脂高糖饲料：达尔文生物有限公司；小鼠均在25℃的动物室中分笼饲养，并保持自然光照，并自由摄入食物和水。

1.2 主要试剂与仪器

骆驼奶（泌乳期为6个月）：新疆天山牧场；盐酸二甲双胍缓释片（批号H）：山西华元医药生物技术有限公司；链脲佐菌素（批号WXBC8740V）：美国SIGMA公司；蛋白定量试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；聚合酶链式反应（PCR）引物：北京睿博兴科生物技术有限公司合成；Trizol试剂、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）等：生工生物工程上海有限公司。

Accu-Chek Active罗氏活力血糖仪及血糖试纸：罗氏血糖健康医护公司；Beckman Optima XPN-100 Ultracentrifuge智能型高效离心机：贝克曼库尔特有限公司；精密电子天平：常州市衡正电子仪器有限公司；Varioskan LUX酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 骆驼奶中外泌体的制备

收集骆驼奶样品40 mL～50 mL。参照Marika等的方法[16]，使用超高速离心法获得外泌体，具体步骤：将新鲜的骆驼奶样品在4℃下于2 000 g离心20 min，收集乳上清；将收集的乳上清在4℃下以12 000 g离心30 min，收集上清；重复一次上步骤。将40 mL的脱脂乳上清液在4℃以110 000 g离心60 min以获得上清乳浆。再将收集的乳上清放入4℃以110 000 g离心2 h收集沉淀，获得外泌体。将沉淀外泌体悬浮在PBS缓冲液中，得到的外泌体溶液放入-20℃冰箱保存，待用。

1.4 外泌体的鉴定

使用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察了骆驼奶中外泌体的形态和粒径大小。将10 μL外泌体悬浮液装载在无定形碳包覆铜网上。通过加入10 μL中性的1%磷钨酸进行负染。然后通过在80 kV加速电压下运行的TEM检查网格中的外泌体。参照Yassin等的方法[17]，使用RT-PCR的方法鉴定所提取的外泌体，将收集的外泌体使用Trizol法提取外泌体总RNA，使用反转录试剂盒反转录成cDNA，GAPDH基因作为参考基因，α酪蛋白基因（α Casein）、β酪蛋白基因（β Casein）和 κ酪蛋白基因（κ Casein）作为标志基因，详细引物序列见表1。

表1 标志基因引物序列Table 1 Marker gene primer sequences注：F为上游引物；R为下游引物。引物序列 产物长度/bp F： 5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′ 153 R： 5′-CTGAGGGCCTCTCTCTTCCT-3′α Casein F：R：基因GAPDH 5′-AGCAGTGGTTTCACCCATTC-3′5′-GCTCTTCCAGATAGCGTTGG-3′206 β Casein F：R：5′-CTCTGCCTCTGCTCCAGTCT-3′5′-ACAGGGACAAGTGGTTGAGG-3′235 κ Casein F：R：5′-CCAAATTATGCCAAGCCAGT-3′5′-GATGGCAGGGTTGACTGTTT-3′153

1.5 T1DM模型小鼠的构建

在注射药品之前，将小鼠禁食12 h。使用时将STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中，并以70 mg/kg腹腔内给药，每隔3 d测血糖，直至模型组血糖显示值大于11.1 mmol/L后，重新喂食普通饲料，两周后检测血糖，检测糖尿病小鼠血糖的稳定性，Ⅰ型糖尿病小鼠制备完成。